style="width:4.04677in;height:0.63242in" /> 本文是学习GB-T 17817-2010 饲料中维生素A的测定 高效液相色谱法. 而整理的学习笔记,分享出来希望更多人受益,如果存在侵权请及时联系我们
本标准规定了饲料中维生素 A 和维生素预混合饲料中维生素 A
乙酸酯的高效液相色谱法测定。
本标准第一法适用于配合饲料、浓缩饲料、复合预混合饲料、维生素预混合饲料中维生素
A 的测
定，定量限为1000 IU/kg。
本标准第二法适用于维生素预混合饲料中维生素A 乙酸酯的测定，定量限为344
mg/kg(10⁶ IU/kg)。
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有
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GB/T 603 化学试剂 试验方法中所用制剂及制品的制备
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 14699.1 饲料 采样
GB/T 20195 动物饲料 试样的制备
碱溶液皂化试样后，用乙醚将维生素 A
提取出来，蒸除溶剂，残渣溶于适当溶剂，注入高效液相色
谱仪分离，在波长326 nm 条件下测定，外标法计算维生素 A 含量。
除特殊注明外，本标准所用试剂均为分析纯，水符合 GB/T 6682
中三级用水规定，色谱用水符合
GB/T 6682 中一级用水规定，溶液按照GB/T 603 配制。
3.2.1 无水乙醚(不含过氧化物)
3.2.1.1 过氧化物检查方法：用5 mL 乙醚加1 mL
碘化钾溶液(3.2.9),振摇1 min, 如有过氧化物则
放出游离碘，水层呈黄色，或加淀粉指示液(3.2.10),水层呈蓝色。该乙醚需处理后使用。
3.2.1.2
去除过氧化物的方法：乙醚用硫代硫酸钠溶液(3.2.11)振摇，静置，分取乙醚层，再用水振摇，
洗涤两次，重蒸，弃去首尾5%部分，收集馏出的乙醚，再检查过氧化物，应符合规定。
3.2.6 2,6-二叔丁基对甲酚(BHT)。
3.2.9 碘化钾溶液：100 g/L。
3.2.10 淀粉指示液：5 g/L (临用现配)。
GB/T 17817—2010
3.2.11 硫代硫酸钠溶液：50 g/L。
3.2.12 氢氧化钾溶液：500 g/L。
3.2.13 L- 抗坏血酸乙醇溶液：5 g/L 。 取0 . 5 gL-
抗坏血酸结晶纯品溶解于4mL 温热的水中，用无水 乙醇(3.2.2)稀释至100 mL,
临用前配制。
3.2.14 酚酞指示剂：10 g/L。
3.2.15 维生素 A 乙酸酯标准品：维生素 A 乙酸酯含量≥99.0%。
3.2.16 维生素A 标准贮备液：称取维生素 A 乙酸酯标准品(3.2.15)34.4
mg (精确至0.00001 g) 于
皂化瓶中，按分析步骤(3.6)皂化和提取，将乙醚提取液全部浓缩蒸发至干，用正己烷溶解残渣置入
100mL
棕色容量瓶中并稀释至刻度，混匀，4℃保存。该贮备液浓度为344μg/mL(1000
IU/mL),临 用前用紫外分光光度计标定其准确浓度。
3.2.17 维生素 A 标准工作液：准确吸取1.00 mL 维生素 A
标准贮备液(3.2.16),用正己烷(3.2.3) 稀释100倍；若用反相色谱测定，将1.00
mL 维生素 A 标准贮备液置入100 mL 棕色容量瓶中，用氮气
吹干，用甲醇(3.2.5)稀释至刻度，混匀，配制工作液浓度为3.44 μg/mL(10
IU/mL)。
3.3.1 分析天平，感量0.001 g。
3.3.2 分析天平，感量0.0001 g。
3.3.3 分析天平，感量0.00001g。
3.3.4 圆底烧瓶，带回流冷凝器。
3.3.5 恒温水浴或电热套。
3.3.8 高效液相色谱仪，带紫外可调波长检测器(或二极管矩阵检测器)。
按照 GB/T 14699.1 的规定执行。
按照 GB/T 20195制备试样，磨碎，全部通过0.28 mm
孔筛，混匀，装入密闭容器中，避光低温保存
备用。
3.6.1.1 皂化
称取试样配合饲料或浓缩饲料10 g,精确至0.001 g,
维生素预混合饲料或复合预混合饲料1 g~ 5g, 精确至0 .0001 g, 置入250 mL
圆底烧瓶中，加50 mLL- 抗坏血酸乙醇溶液(3.2.13),使试样完全
分散、浸湿，加10 mL 氢氧化钾溶液(3.2.12),混匀。置于沸水浴上回流30 min,
不时振荡防止试样粘 附在瓶壁上，皂化结束，分别用5 mL 无水乙醇(3.2.2)、5
mL 水自冷凝管顶端冲洗其内部，取出烧瓶冷
却至约40℃。
3.6.1.2 提取
定量转移全部皂化液于盛有100 mL 无水乙醚(3.2. 1)的500 mL
分液漏斗中，用30 mL～50 mL
水分2次～3次冲洗圆底烧瓶并入分液漏斗，加盖、放气、随后混合，激烈振荡2
min, 静置、分层。转移 水相于第二个分液漏斗中，分次用100 mL、60mL
乙醚重复提取两次，弃去水相，合并三次乙醚相。用
水每次100 mL
洗涤乙醚提取液至中性，初次水洗时轻轻旋摇，防止乳化。乙醚提取液通过无水硫酸钠
(3.2.7)脱水，转移到250 mL 棕色容量瓶中，加100 mg
BHT(3.2.6)使之溶解，用乙醚定容至刻度
(V₁ )。 以上操作均在避光通风柜内进行。
GB/T 17817—2010
3.6.1.3 浓缩
从乙醚提取液(V₁) 中分取一定体积(V₂)
(依据样品标示量、称样量和提取液量确定分取量)置于旋
转蒸发器烧瓶中，在水浴温度约50℃,部分真空条件下蒸发至干或用氮气吹干。残渣用正己烷溶解(反
相色谱用甲醇溶解),并稀释至10 mL(V₃) 使其维生素 A 最后浓度为每毫升5
IU～10IU, 离心或通过
0.45μm
过滤膜过滤，用于高效液相色谱仪分析。以上操作均在避光通风柜内进行。
3.6.2.1 色谱条件
3.6.2.1.1 正相色谱
色谱柱：硅胶 Si60, 长125 mm, 内 径 4 mm, 粒 度 5 μm
(或性能类似的分析柱);
流动相：正己烷+异丙醇(98+2);
流速：1.0 mL/min;
温度：室温；
进样量：20μL;
检测波长：326 nm。
3.6.2.1.2 反相色谱
色谱柱：Ci₈ 型柱，长125 mm, 内径4.6 mm, 粒 度 5 μm
(或性能类似的分析柱);
流动相：甲醇+水(95+5);
流速：1.0 mL/min;
温度：室温；
进样量：20μL;
检测波长：326 nm。
3.6.2.2 定量测定
按高效液相色谱仪说明书调整仪器操作参数，向色谱柱注入相应的维生素 A
标准工作液(3.2.17)
和试样溶液(3.6.1),得到色谱峰面积响应值，用外标法定量测定，维生素 A
标准色谱图参见图 A. 1。
3.6.2.3 结果计算
3.6.2.3.1 试样中维生素 A 的含量，以质量分数 X₁
计，数值以国际单位每千克(IU/kg) 或毫克每千 克(mg/kg)
表示，按式(1)计算：
式中：
style="width:4.04677in;height:0.63242in" />
…… ……………
(1)
P₁—— 试样溶液(3.6.1)峰面积值；
V₁— 提取液的总体积，单位为毫升(mL);
V³—— 试样溶液最终体积，单位为毫升(mL);
pi— 维生素 A 标准工作液(3.2.17)浓度，单位为微克每毫升(μg/mL);
P₂— 维生素 A 标准工作液(3.2.17)峰面积值；
m₁—— 试样质量，单位为克(g);
V₂— 从提取液(V₁) 中分取的溶液体积，单位为毫升(mL);
fi— 转换系数，1国际单位(IU) 相当于0.344 μg 维生素 A 乙酸酯，或0.300μg
视黄醇活性。
3.6.2.3.2 平行测定结果用算术平均值表示，保留三位有效数字。
3.6.2.4 重复性
同一分析者对同一试样同时两次平行测定所得结果的相对偏差见表1。
GB/T 17817—2010
表 1 相对偏差
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维生素预混料中的维生素 A
乙酸酯用甲醇溶液提取，试液注入高效液相色谱柱，在326 nm 处测
定，外标法计算维生素 A 乙酸酯含量。
除特殊注明外，本标准所用试剂均为分析纯，水符合 GB/T 6682
中三级用水规定，色谱用水符合
GB/T 6682 中一级用水规定。
4.2.1 维生素 A 乙酸酯标准品：维生素 A 乙酸酯含量≥99.0%。
4.2.2 维生素A 乙酸酯标准贮备液：称取维生素 A
乙酸酯标准品(4.2.1)34.4 mg (精确至0.00001 g), 于100 mL
棕色容量瓶中，用甲醇(3.2.5)溶解并稀释至刻度，混匀，4
℃保存。该贮备液浓度为 344 μg/mL(1000
IU/mL),临用前用紫外分光光度计标定其准确浓度。
4.2.3 维生素A 乙酸酯标准工作液：准确吸取维生素 A
乙酸酯标准贮备液(4.2.2)1.0 mL 于100 mL
棕色容量瓶中，用甲醇(3.2.5)稀释至刻度，混匀，配制工作液浓度为3.44
μg/mL(10 IU/mL)。
4.3.2 其他同3 .3。
同3.4。
同3 . 5。
称取试样1 g, 精确至0 .0001 g, 置于100 mL 的棕色容量瓶中，加入约80 mL
的甲醇，瓶塞不要拧 紧，于65℃超声波水浴中超声提取30 min,
冷却至室温，用甲醇稀释至刻度，充分摇匀。如果试样中维 生素 A
乙酸酯的标示量低于10⁷ IU/kg, 则将溶液过0.45 μm
滤膜，进样测定，否则需将溶液用甲醇进
一步稀释，使维生素 A 乙酸酯的进样浓度与维生素 A
乙酸酯标准工作液浓度接近。
4.6.2.1 色谱条件
色谱柱：Ci&型柱，长150 mm, 内径4 . 6 mm, 粒 度 5 μm
(或性能类似的分析柱);
流动相：甲醇+水(98+2);
流速：1.0 mL/min;
温度：室温；
进样量：20μL;
检测波长：326 nm。
GB/T 17817—2010
4.6.2.2 定量测定
按高效液相色谱仪说明书调整仪器操作参数，向色谱柱注入相应的维生素 A 乙
酸 酯 标 准 工 作 液 (4.2.3)和试样溶液(4.6.
1),得到色谱峰面积响应值，用外标法定量测定，维生素 A 乙酸酯标准色谱图
参见图 A.2。
4.6.2.3 结果计算
4.6.2.3.1 试样中维生素 A 乙酸酯的含量，以质量分数 X2
计，数值以国际单位每千克(IU/kg) 或 毫
克每千克(mg/kg) 表示，按式(2)计算：
style="width:3.36678in;height:0.61996in" /> (2)
式 中 ：
P₃—— 试样溶液(4.6. 1)峰面积值；
V—— 试样溶液(4.6. 1)的总稀释体积，单位为毫升(mL);
p₂ 维生素 A 乙酸酯标准工作液(4.2.3)浓度，单位为微克每毫升(μg/mL);
P₄—— 维生素 A 乙酸酯标准工作液(4.2.3)峰面积值；
m₂—— 试样质量，单位为克(g);
f₂— 转换系数，1 国际单位(IU) 相当于0 . 344 μg 维生素 A 乙酸酯。
4.6.2.3.2 平行测定结果用算术平均值表示，保留三位有效数字。
4.6.2.4 重复性
同 一 分析者对同 一 试样同时两次平行测定所得结果的相对偏差不大于10%。
GB/T 17817—2010
(资料性附录)
维生素 A、维生素 A 乙酸酯标准色谱图
style="width:10.00656in;height:3.24676in" />
图 A.1 维 生 素 A 标准色谱图
style="width:9.92679in;height:3.27998in" />
图 A.2 维 生 素 A 乙酸酯标准色谱图
style="width:4.14668in;height:1.85988in" />
中 华 人 民 共 和 国
国 家 标 准
饲料中维生素 A 的测定
高效液相色谱法
GB/T 17817—2010
¥
中国标准出版社出版发行 北京复兴门外三里河北街16号
邮政编码：100045
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中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷
各地新华书店经销
开本880×1230 1/16
2010年11月第一版
关
印张0.75 字数12 千字
2010年11月第一次印刷
关
书号：155066 ·1-40641
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